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S-亚硝基化蛋白如何检测?小艾给您支招

发布者:ca88国际平台    发布时间:2021-11-17     
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NO作为一种简单的信号分子,广泛存在于各生物体组织中。NO有非常活跃的氧化还原特性,赋予了它独特,重要的生理功能,NO可以与蛋白质特定位点的半胱氨酸上的巯基残基特异性的共价结合,发生S-亚硝基化修饰作用,得到S-亚硝基巯基,从而进一步调节目标蛋白的结构和活性。

 

大量研究结果证实,蛋白质S-亚硝基化在生物体内具有很多重要的生理学作用,亚硝基化蛋白产物在多种疾病中表现出异常升高和降低,关节炎、支气管肺炎、糖尿病、多种硬化症、中风等疾病中蛋白质巯基亚硝基化产物较正常水平明显增多;在哮喘、新生儿血氧不足、肺气肿等疾病中蛋白质巯基亚硝基化产物较正常水平明显降低。


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S-亚硝基化蛋白检测:

鉴于蛋白的S-亚硝化在诸多疾病中的广泛生理学作用,对样本中的S-亚硝化蛋白水平进行准确检测就显得尤为重要了,在这里,艾美捷给您带来了一款大家都在用的S-亚硝化蛋白检测试剂盒(Cat# 10006518,该试剂盒基于经典的生物素转换原理,将-S-NO转化为S-C-Biotin,再通过检测生物素来表征-S-NO,该试剂盒使用简单、方便、用时短,样品可直接用于WB检测和IF检测,在Nature Cell Biology,Nature Communication,Cancer Research等众多高分杂志上被引用。

 

S-亚硝基化蛋白检测

 

检测原理:1. 封闭样本蛋白上游离的巯基; 2. 样本蛋白上S-亚硝基巯基被还原生成与马来酰亚胺生物素共价标记的游离硫醇; 3. 随后用亲和素偶联试剂检测生物素标记的蛋白。


将样本中S-亚硝基化蛋白带上生物素标记之后,该试剂盒提供了2种表征S-亚硝基化蛋白的方法:

1、类似于WB的方法:用链霉亲和素标记的HRP去定位生物素标记的蛋白,然后再用HRP的底物进行检测,适合于检测细胞/组织裂解液中的S-亚硝基化蛋白。

2、类似于IHC/IF的方法:这种方法也是将蛋白上的S-NO基团用生物素取代,然后用链霉亲和素标记的荧光素进行定位检测,只是样本处理方法跟WB法不太一样,此方法适合于检测细胞/组织切片中的S-亚硝基化蛋白。

 

相关产品推荐:

产品名称规格货号
S-亚硝基化蛋白检测试剂盒1ea10006518
Biotin-HPDP10mg16459
SNOB 1 Reagent1mg17215


10006518使用过程中的常见问题(FAQ):


1、在S-亚硝化蛋白检测试剂盒(Cat# 10006518)检测过程中,是否有哪个步骤可以暂时中止实验然后将样本过夜保存

是的,可以在样品制备部分(Sample Preparation)下的Step 7或Step 13两个步骤中,在丙酮将蛋白沉淀后即可暂时中止实验,然后将沉淀物在-20°C下过夜保存。

 

2、如果没有暗室,在间接光照下进行Step 1-12可以吗

如果没有暗室,您可以关闭实验室中的部分顶灯,并避免在工作台上开灯直射。


3、试剂盒说明书中,只有针对于细胞样本处理方案没有针对完整组织的方案完整的组织能用这个试剂盒吗

对于软组织样本,可以分离细胞:分离,洗涤和沉淀细胞,按Step 3裂解细胞并封闭游离巯基。对于硬组织样品,在20mM Tris pH 8.0或P-SNO细胞裂解液(Buffer A)中制备0.1g/ml缓冲液匀浆。离心(1000xg,10min)除去大的细胞碎片。如果需要进一步匀浆处理,将上清至于-20℃孵育1h,再将冰冷的上清液重复匀浆化或者超声处理(确保完全裂解,通过显微镜检查是否剩余完整细胞)。如果需要,定量蛋白质浓度并稀释至2mg / mL,将复溶的封闭试剂(1ml储备液)以1:9的比例加入到当前的样品中,此时的样品可视作Step 4中细胞裂解液。


4、这个试剂盒是可以用含有β-巯基乙醇Laemmli缓冲液

是的,这个试剂盒可以用含有β-巯基乙醇的Laemmli缓冲液,β-巯基乙醇不会影响蛋白上标记的生物素。

 

5、这款S-亚硝基化蛋白质检测试剂盒适用的样品类型有哪些了

这款试剂盒适用的样本类型有:培养的细胞、血细胞沉淀、纯化的蛋白质。如果样本是纯化的蛋白质,首先需要将蛋白质样品在含有封闭试剂的Buffer A中重新配制成2mg / ml; 这个浓度将使封闭试剂过量。此时,蛋白质上的游离巯基将被封闭,然后可以继续Step 6中丙酮沉淀步骤。对于凝胶分析,每个泳道加载1-5μg蛋白质就可以,以避免加载过量的蛋白质。

 

部分引文赏析:

1.Li, L., Zhu, L., Hao, B., et al. iNOS-derived nitric oxide promotes glycolysis by inducing pyruvate kinase M2 nuclear translocation in ovarian Oncotarget 8(20), 33047-33063 (2017).

2.Lee, W.-B., Kang, J.-S., Choi, W.Y., et al. Mincle-mediated translational regulation is required for strong nitric oxide production and inflammation resolution. Nat. Commun. 7, 11322 (2016).

3.Vatolin, S., Phillips, J.G., Jha, B.K., et al. Novel protein disulfide isomerase inhibitor with anticancer activity in multiple myeloma. Cancer Res. 76(11), 3340-3350 (2016).

4.Salanova, M., Schiffl, G., Gutsmann, M., et al. Nitorsative stress in human skeletal muscle attenuated by exercise countermeasure after chronic disuse. Redox Biol. 1, 514-526 (2013).

5.Park, Y.-J., Yoon, S.-J., Suh, H.-W., et al. TXNIP deficiency exacerbates endotoxic shock via the induction of excessive nitric oxide synthPLoS Pathog. 9(10), e1003646 (2013).

 

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